由于添加劑濃度不同、孵育時(shí)間不同、染色類(lèi)型或者細(xì)胞系不同等參數(shù)的不同，實(shí)驗(yàn)通常在多孔板上進(jìn)行。這種方法有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)，一是能夠在一個(gè)反應(yīng)容器中設(shè)置多個(gè)不同的試驗(yàn)條件，二是只需要極少量的試劑和極低數(shù)量的細(xì)胞。

但是，在實(shí)施過(guò)程中，用戶(hù)仍然可能會(huì)被不同孔和不同實(shí)驗(yàn)的數(shù)量混淆。

設(shè)置多孔板實(shí)驗(yàn)時(shí)，MICA自帶的Navigator工具能夠幫助預(yù)覽。包括可以在虛擬畫(huà)板上計(jì)劃并設(shè)置每一孔的掃描拼接實(shí)驗(yàn)或者延時(shí)實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)圖1）。

在這一案例研究中使用的檢測(cè)法中， U2OS細(xì)胞或者COS7細(xì)胞被鋪在96孔板，然后培養(yǎng)一整晚的時(shí)間。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，活細(xì)胞分別用DRAQ5、SPY-650-DNA以及TMRE孵育15分鐘。之后，更換培養(yǎng)基，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前使用CellEvent™孵育細(xì)胞。每孔內(nèi)加入凋亡誘導(dǎo)劑星形孢菌素（3 µM–7 µM）。

在四色caspase活性檢測(cè)法中，U2OS細(xì)胞被接種在96孔板上并在夜間生長(zhǎng)，然后培養(yǎng)一整晚的時(shí)間。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，活細(xì)胞與DAPI和TMRE孵育45分鐘。之后，更換培養(yǎng)基，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前使用CellEvent™和SiR-Tubulin孵育細(xì)胞。每孔內(nèi)加入凋亡誘導(dǎo)劑—星形孢菌素（3 µM–7 µM）。

在37℃、5% CO2和~65%濕度的環(huán)境中，按照指示的時(shí)間間隔和持續(xù)時(shí)間用MICA進(jìn)行活細(xì)胞成像。使用Navigator工具設(shè)定并執(zhí)行檢測(cè)。一些實(shí)驗(yàn)中會(huì)運(yùn)行掃描拼接（參見(jiàn)視頻2）。進(jìn)行掃描拼接時(shí)，研究人員使用的主要策略是“focus Map”；此外，延時(shí)實(shí)驗(yàn)通過(guò)“Keep focus”來(lái)保持細(xì)胞的聚焦。

視頻 2：三色caspase活性檢測(cè)的掃描拼接片。U2OS細(xì)胞分別用核標(biāo)記SPY-650-DNA（藍(lán)色）、線粒體膜電位標(biāo)記TMRE（品紅）和CellEvent™（黃色）處理。加入5mM星形孢菌素以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。使用20x物鏡，在明亮視野和兩種熒光通道下，12小時(shí)內(nèi)每15分鐘獲取一次2x2 FOVs（視野范圍）的掃描拼接圖像。隨著時(shí)間增加，Caspase活性增強(qiáng)，線粒體活性減弱。

SPY-650-DNA（標(biāo)記細(xì)胞核）和CellEvent™（標(biāo)記caspase 3/7活性）兩種細(xì)胞染料的量化研究揭示了在活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)生caspase介導(dǎo)的凋亡的細(xì)胞。細(xì)胞核的數(shù)量（此處選擇“范圍”參數(shù)做類(lèi)比）說(shuō)明了每張圖像中細(xì)胞的數(shù)量（同選“范圍”），可與處于凋亡過(guò)程中細(xì)胞的數(shù)量（同選“范圍”）相對(duì)應(yīng)。另一個(gè)標(biāo)記，即TMRE成像過(guò)程，揭示了線粒體活性。

量化數(shù)據(jù)(如長(zhǎng)度、寬度、面積)顯示在采集圖像下方的表格中，這些數(shù)據(jù)可被導(dǎo)出為Excel表格。獲取的圖像可以在延時(shí)成像的每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)上查看，并可以與識(shí)別的ROI重疊。

三色caspase 3/7活性檢測(cè)圖（圖4）顯示，細(xì)胞核信號(hào)在開(kāi)始的時(shí)候增強(qiáng)，之后逐漸減弱。信號(hào)增強(qiáng)是因?yàn)楹巳旧珓┍仨毰cDNA結(jié)合，這一結(jié)合過(guò)程需要一定的時(shí)間。另一方面，SPY-650-DNA信號(hào)減弱是因?yàn)榧?xì)胞核解體，解體現(xiàn)象見(jiàn)相關(guān)圖像。

其他信號(hào)要么隨時(shí)間增加而增強(qiáng)（CellEvent™），要么隨時(shí)間增加而減弱（TMRE）： caspase介導(dǎo)的凋亡細(xì)胞數(shù)量增加的同時(shí)激活狀態(tài)的線粒體數(shù)量減少。

Caspase活性檢測(cè)法為研究抗癌藥物提供了新的見(jiàn)解。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，研究人員必須在保證高時(shí)空精準(zhǔn)度的情況下將活細(xì)胞從凋亡細(xì)胞中區(qū)分出來(lái)。

對(duì)于統(tǒng)計(jì)上可靠的結(jié)果，增加量很有必要。這就是為什么這類(lèi)實(shí)驗(yàn)必須在孔板上進(jìn)行，也必須進(jìn)行量化研究。

MICA滿(mǎn)足以上全部要求。在FluoSync的幫助下，Mica可同時(shí)保證多達(dá)4種不同的熒光染料可以同時(shí)成像，不論是在單一培養(yǎng)皿上，還是在96孔板上。MICA完整的培養(yǎng)系統(tǒng)能夠培育活細(xì)胞數(shù)日，同時(shí)其自帶的基于人工智能的分析功能也有助于用戶(hù)獲得可靠的數(shù)據(jù)。