無色活體標本借助生物顯微鏡。不同的顯微技術旨在改變相移光與試樣的相互作用將試樣轉化為振幅偏移人眼可見的亮度差異。

活體樣本可視化的挑戰

明視野顯微鏡通常只能提供未染色標本的微弱圖像，其中只能檢測到一些細節。要在圖像中看到更多細節，增強對比度非常重要。增強對比度的一種方法是對樣本進行染色。然而，這對生物體來說是不可能的，因此它們不會著色，看起來也不明顯。實際上，這些樣本也會與光學顯微鏡中的入射光發生相互作用。然而，所發生的相移是人眼無法察覺的。眼睛只能感受到振幅（亮度）和頻率（顏色）的變化。

對比度是指區分樣品和背景以及發現樣品細節的可能性。對比度的定義是圖像和相鄰背景之間的光強與整體背景光強之間的差異。對于人眼來說，這些差異至少要達到百分之二才能被檢測到。使用光電探測器可以大大提高對比度。

然而，對比度不僅取決于樣本及其與光的相互作用本身。用于觀察樣本的光學系統及其記錄圖像信息的能力也至關重要。在顯微系統中，對比度取決于正確的光圈設置、光學像差的等級、使用的對比度方法、標本和探測器。

因此，通過改變光闌的光圈設置，光學顯微鏡所獲得圖像的對比度可以不受對比度方法的影響。但是，如果聚光鏡等縮小得太多，分辨率就會受到影響，并可能出現衍射偽影。

要獲得足夠的對比度，最古老的方法可能是先對樣品進行染色。通常情況下，這只適用于死物，有時還需要一些復雜的染色方案。如果要觀察活細胞，染色就不容易做到。因此，不同的技術（由適當的光學顯微鏡提供）旨在將光與樣本相互作用產生的相移轉變為幅移。

相位對比和微分干涉對比（DIC ）就是這些對比方法的例子。其他光學對比方法還有暗場對比和偏振對比。

圖 1：振幅對象和相位對象。上排：當光線穿過所謂的振幅物體（紅框）時，光波的振幅（A）會降低（ΔA）。人眼會感覺到亮度降低。中間一行：在所謂的相位物體中，光線通過物體時會導致光波的相位移動 (Δj)，人眼無法察覺。下排：未發生變化的光波。

光與樣本之間的相互作用

如果入射光照射到試樣上，它們就會發生相互作用。吸收、反射、衍射、光散射和折射都是可能的結果。在此過程中，入射光波會發生變化。相位移動和振幅變化都是可能的。在這方面，我們可以區分相位物體和振幅物體。在理想情況下，相位對象是改變光波相位而非振幅的樣本。相反，振幅對象只影響光的振幅而不影響光的相位。對于可見光而言，扁平和未染色細胞幾乎達到了相位對象的特征。由于它們只是導致人眼無法看到的相位偏移，因此在明視野顯微鏡下的對比度非常低。振幅物體本身在明視野顯微鏡中的成像效果非常好。它們會降低振幅，從而降低通過光的強度。染色或自然著色的物體可以在明視野中很好地顯示出來。它們屬于振幅物體。它們會減弱通過的光線，從而減小波面的振幅。但它們并不是理想的振幅物體。除了振幅之外，它們還會影響入射光的成分。它們會吸收或反射特定頻率的光波，而其他波長的光則可以不受阻礙地通過。由于試樣和周圍介質的折射率不同，會產生相移。如果光波進入細胞，它會準減速，而振幅保持不變。當光波離開細胞時，它會恢復速度，并以與之前相同的頻率、波長和振幅穿過介質。然而，與只穿過介質的光相比，它的相位發生了偏移。由于人眼和其他光學檢測器無法識別和檢測光波的相位變化，因此在未染色和未著色的標本中，對比方法的主要目的是產生振幅對比，并將相位對比轉變為振幅對比。

圖 2a：兔味蕾切片，相襯顯微鏡

圖 2b：兔味蕾切片，微分干涉對比顯微鏡

圖 2c：兔味蕾切片，明視野顯微鏡

對生物研究產生巨大影響

與使用固定和染色的物體相比，使用未染色標本具有許多優勢。它允許在生物顯微鏡下觀察活體，沒有固定和染色的人工痕跡。例如，固定和染色會使標本收縮或膨脹。此外，還有可能破壞細胞中的獨特結構或嚴重改變其形態。消除這種危險的可靠方法就是使用活體樣本，因為活體樣本沒有偽影，能提供可靠、真實的信息。

活細胞顯微鏡的另一大優勢是可以檢查隨時間變化的情況。除了獲得細胞的靜態信息和情況快照外，還可以隨時監測整個過程，如細胞運動、細胞分裂和細胞凋亡。由于這些過程有時會耗費大量時間，因此最好在光學顯微鏡系統中添加一個攝像頭，以記錄延時影片。

不同的光學對比方法所獲得的信息和印象因其來源而異。因此，建議結合使用不同的對比技術，以獲得最準確、最詳細的受檢樣本圖像。明視野通常無法準確觀察細胞的形態，而其他光學對比方法則可以提供更多信息。

在活細胞圖像中添加熒光標記可獲得更多信息。可以用 GFP 等熒光蛋白標記細胞中感興趣的蛋白質。然后就可以通過光鏡圖像追蹤并準確確定其在細胞內的定位。此外，還可以將 GFP 與多肽定位信號結合起來。通過這種方法，像內質網這樣的獨特區塊就可以被可視化。

研究中使用的現代光學顯微鏡通常采用模塊化設計，可以在各種對比方法之間快速切換，甚至可以同時使用。光學對比方法為在實驗室日常工作中輕松檢查活體和無色標本提供了可能。

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