使用電鏡載網作為載體，減少樣品厚度，以支持高效的低溫電子顯微鏡工作流程。

本文介紹了一種特殊的高壓冷凍方法，即 "Waffle 方法 "的優點。了解 "Waffle 方法 "如何使用電鏡載網作為高壓冷凍的載體，從而減少樣本厚度并支持復雜生物樣本的高效低溫電子顯微鏡工作流程。此外，本文還強調了現代 HPF 系統-徠卡顯微系統公司 EM ICE 的優勢，并列舉了 EM ICE 用于 "Waffle方法 "的參考文獻。

"Waffle 方法 "

高壓冷凍（HPF）已成為低溫電子斷層成像技術（cryo-ET）的基石，它能以很高的保真度保存原始生物結構，尤其是在厚樣本或復雜樣本中。為此，通常要在冷凍樣品，并所形成的最大200微米玻璃化區域。遺憾的是，玻璃化后的大體積樣品，必須在多個維度上進行銑削，以制備樣品薄片，然后才能進行電子斷層掃描。

近年來有一種樣品制備方法越來越流行：“Waffle方法"，特別是對于較厚的樣品。這種方法的基礎由McDonald等人在2010年奠定，并由Mahamid等人在2015年進一步調整，他們首先使用載網作為HPF銅盤之間的樣品載體（圖 4）。隨后，Kelley等人在2022年的一項研究中正式采用了 "華夫餅法 "這一術語，對該技術進行了標準化，并將其應用擴展到各種生物系統中。

與標準的 HPF 厚樣品相比，該技術的優勢在于為后續的FIB銑削提供了更小體積的樣品。樣品被放入載網中，碳膜面朝下。這樣，在HPF制備后，柵格內會形成一個玻璃化的 "圓盤"，厚度約為20-30 µm，而不是100-200 µm。因此，樣品所需玻璃化冰層深度大大減少。圖 1 顯示了成功進行HPF制備后，電鏡載網上的小鼠海馬腦切片熒光圖像（Matsui等人，2024年）。

圖 1：HPF 制備后載網上的小鼠海馬腦切片結果；綠色熒光為PSD95-EGFP。Aya Matsui, Cathy Spangler, Johannes Elferich, Momoko Shiozaki, Nikki Jean, Xiaowei Zhao, Maozhen Qin, Haining Zhong, Zhiheng Yu, Eric Gouaux (2024) Cryo-electron tomographic investigation of native hippocampal glutamatergic synapses eLife 13:RP98458;

載網骨架可以穩定網格方格中的結構，以便進行FIB銑削，尤其是在獲得約200納米薄片時。在Kelley等人繪制的圖2中，我們可以看到隱藏在圖像下的載網骨架。在載網骨架上方，有5對明顯的溝槽，以便隨后對目標薄片進行精細銑削。

圖 2：5 對預制溝槽的Waffle樣品的掃描電鏡圖像。在圖像的下部，可以看到電鏡載網的柵條。比例尺：100 微米。Kelley, K., Raczkowski, A.M., Klykov, O. et al. Waffle Method: A general and flexible approach for improving throughput in FIB-milling. Nat Commun 13, 1857 (2022).

圖 3 顯示了一個薄片樣品，在所有方向上都有微孢子蟲，它是通過 "Waffle方法 "制備的，沒有使用冷凍投入技術。

圖 3：一個完整的Waffle薄片樣品（右側為缺口磨盤）的SEM圖像，顯示了微孢子蟲孢子的幾種排列方向。比例尺：10 微米。Kelley, K., Raczkowski, A.M., Klykov, O. et al. Waffle Method: A general and flexible approach for improving throughput in FIB-milling.Nat Commun 13, 1857 (2022).

除了上述優點外，載網還可以最終安裝到低溫-TEM 固定器中，而標準厚樣品則無法做到這一點。這就避免使用復雜的樣品轉移方法，以及將薄片轉移到特定支架上進行低溫 TEM 層析成像的危險步驟。

先進的自動高壓冷凍儀：EM ICE

EM ICE 高壓冷凍機特別適用于 "Waffle方法"，因為它有幾個主要特點，符合該方法對精確性、可重復性以及與大體積或結構化樣品的兼容性的要求：

兼容載網作為樣品載體

“Waffle方法 "是將樣品放在由兩個拋光銅盤夾著的載網中。EM ICE支持根據試樣需要定制銅盤和隔板，從而實現一致的試樣厚度的冷凍幾何形狀。根據試樣的大小，可使用不同的載網類型（網格孔直徑從90微米到500微米不等，通常為正方形，也有六邊形）。

圖 4：使用"Waffle 方法 "的 HPF 典型設置。

高通量和可重復性

EM ICE設計用于可重復的冷凍循環，這在制備多個 "Waffle "樣品用于高通量低溫 FIB 銑削時至關重要。

樣品干擾小

該系統可對樣品進行溫和處理，并快速轉移到液氮中，從而降低了機械損傷或蛻變的風險--這在處理精細的載網組件時尤為重要。

與下游低溫工作流程集成

EM ICE廣泛應用于包括Cryo-FIB/SEM和Cryo-ET在內的工作流程，使其成為 "Waffle方法 "的天然之選，而 "Waffle方法 "依賴于從冷凍到銑削，再到成像的有效工作流程。

使用EM ICE進行"Waffle方法 "樣品制備

最近，Pge等人（elifeSciences）將使用 "Waffle方法 "的樣品制備技術擴展到植物組織 。研究人員使用了苔蘚、擬南芥和雙色檸檬（海熏衣草）的組織。

Schi?tz等人在《自然-方法》（Nature Methods）雜志上介紹了 "序列提取"（Serial Lift-Out）技術，該技術結合了HPF和高通量Cryo-FIB銑削技術，可從單個樣本中提取多個薄片。這樣就能對多細胞生物體進行體積取樣，例如C. elegans同時保持大面積組織的完整的超微結構。

在eLife中， Matsui等人將HPF應用于小鼠腦組織，并將其與低溫光電聯用技術相結合，研究原生海馬突觸 。他們的方法確保了神經回路的快速玻璃化，從而可以在原位對AMPA受體進行精確定位和結構分析。

Berger等人（bioRxiv）證明了HPF與氙等離子FIB銑削技術的兼容性，實現了從厚樣品中高通量制備薄片。他們的工作實現了近原子分辨率的重建，如大腸桿菌4.0 ? 的核糖體 ，強調了 HPF 在保護大分子結構方面的關鍵作用。

致謝

本應用說明展示了以下文章的圖片，采用知識共享許可協議（署名 4.0 國際版），如 CreativeCommons

Waffle Method: A general and flexible approach for improving throughput in FIB-milling.

Kelley, K., Raczkowski, A.M., Klykov, O. et al.

Nat Commun 13, 1857 (2022)。

Cryo-electron tomographic investigation of native hippocampal glutamatergic synapses

Aya Matsui, Cathy Spangler, Johannes Elferich, Momoko Shiozaki, Nikki Jean, Xiaowei Zhao, Maozhen Qin, Haining Zhong, Zhiheng Yu, Eric Gouaux

eLife 13:RP98458 (2024).

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